在大鼠ELISA實(shí)驗(yàn)中，終止液（通常為2mol/L H?SO?）的作用是通過強(qiáng)酸性環(huán)境破壞辣根過氧化物酶（HRP）的活性，從而立即停止TMB底物的顯色反應(yīng)。若漏加終止液，酶促反應(yīng)將繼續(xù)，藍(lán)色會(huì)持續(xù)加深，吸光度（OD值）不斷上升，嚴(yán)重影響定量準(zhǔn)確性。
常見錯(cuò)誤與注意事項(xiàng)：
不能跳過終止步驟：有文獻(xiàn)指出部分ELISA可在不加終止液的情況下直接讀數(shù)，但這需嚴(yán)格控制時(shí)間且波長(zhǎng)不同（終止前~650nm，終止后~450nm），常規(guī)檢測(cè)必須加終止液以穩(wěn)定顏色并轉(zhuǎn)換至標(biāo)準(zhǔn)波長(zhǎng)。
洗板無法替代終止：洗滌只能去除游離成分，不能滅活已結(jié)合的HRP酶，反應(yīng)仍會(huì)繼續(xù)。
安全操作：補(bǔ)加時(shí)避免產(chǎn)生氣泡，使用一次性吸頭防止交叉污染。
漏加終止液的影響與補(bǔ)救策略
影響階段 | 是否可補(bǔ)救 | 補(bǔ)救方法 |
剛發(fā)現(xiàn)漏加，顯色仍在進(jìn)行中 | ? 可補(bǔ)救 | 立即每孔加入50μl終止液，混勻后馬上測(cè)定OD值（450nm） |
已超過推薦讀數(shù)時(shí)間（如>15分鐘），但顏色未明顯褪去 | 部分有效 | 補(bǔ)加終止液后立即讀數(shù)，并在結(jié)果分析時(shí)注明“延遲終止"，謹(jǐn)慎解讀 |
顯色已長(zhǎng)時(shí)間未終止，TMB可能已降解或沉淀 | ? 難以補(bǔ)救 | 數(shù)據(jù)不可靠，建議重做實(shí)驗(yàn) |
建議
立即行動(dòng)：一旦發(fā)現(xiàn)漏加，應(yīng)第一時(shí)間補(bǔ)加終止液并讀數(shù)。
記錄異常：在實(shí)驗(yàn)記錄中標(biāo)明“漏加終止液，于XX分鐘后補(bǔ)加"，便于后續(xù)數(shù)據(jù)分析和復(fù)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)。
預(yù)防為主：使用標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（SOP）或排槍配合多通道移液器，減少人為失誤。
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